Что такое ПЦР.

 
Принцип этой реакции достаточно прост и теоретически для её исполнения нужны лишь пробирка, несколько реагентов и источник тепла. Препарат ДНК, который необходимо копировать, может быть чистым, а может представлять собой очень сложную смесь биологических веществ. В качестве источника ДНК подходит и биоптат ткани пациента, и одиночный человеческий волос, и капля засохшей крови, обнаруженная на месте преступления, и мозг мумии и даже тело мамонта, пролежавшего 40 000 лет в вечной мерзлоте.
Основные медицинские области применения этого метода – диагностика инфекций и наследственных заболеваний.
Но, пожалуй, самое широкое распространение метод ПЦР в настоящее время получил как метод диагностики различных инфекционных заболеваний. ПЦР позволяет выявлять этиологию инфекции даже если в пробе, взятой на анализ содержится всего несколько молекул ДНК возбудителя. ПЦР широко используется в для ранней диагностики ВИЧ-инфекции, вирусных гепатитов, клещевого энцефалита, туберкулеза, заболеваний, передающихся половым путем и т.д. На сегодняшний день практически нет инфекционного агента, которого нельзя было бы выявить с помощью ПЦР.
Принцип полимеразной цепной реакции заключается в удвоении (амплификации) участка ДНК, ограниченного праймерами (- цепочка из 20 - 30 нуклеотидов, расположенных в определенном порядке. В полимеразной цепной реакции этот порядок соответствует участку ДНК того возбудителя, на который проводится анализ.), при помощи фермента ДНК-полимеразы.
За каждый следующий цикл амплификации происходит удвоение как исходного участка ДНК, так и вновь синтезированных фрагментов (амплификатов). В результате этого число фрагментов растет в геометрической прогрессии (цепная реакция). После 30 - 40 циклов их число превышает несколько миллиардов, что делает возможным их обнаружение различными методами.
Однако, для процесса амплификации необходимо, чтобы структура праймеров была идентична (комплементарна) участку исходной ДНК, т.е. ДНК возбудителя. Если этого не происходит (отсутствует специфическая ДНК возбудителя ), то удвоения ДНК не происходит.
Если в растворе не окажется ни одной молекулы ДНК с участком, комплементарным внесенным праймерам, то реакция ПЦР не пойдет, даже несмотря на то, что в растворе будет плавать миллион других молекул ДНК. Этим и обусловлена высокая специфичность метода ПЦР.

Преимуществами метода ПЦР являются:

1. Универсальность. При помощи ПЦР можно определять ДНК в любых биологических образцах. Причем это в равной степени относится как к ДНК микроорганизмов, так и к ДНК человека.

2. Высокая специфичность. Специфичность определяется тем, что в ПЦР определяется уникальный участок гена, характерный только для данного возбудителя.
3. Высокая чувствительность. Полимеразная цепная реакция способна выявлять единичные копии ДНК. В среднем порог чувствительности большинства современных тест-систем составляет от 10 до 100 копий ДНК. Это значительно превышает чувствительность культуральных методов исследования.

4. Малый объем биологического материала. Проведение анализа возможно в минимальном объеме пробы (до нескольких микролитров), что крайне важно в педиатрии, неонатологии, неврологии, судебной медицине.

5. Возможность диагностики не только острых, но и латентных инфекций. Особенно эффективен метод ПЦР для диагностики трудно культивируемых, некультивируемых и персистирующих форм микроорганизмов, с которыми часто приходится сталкиваться при латентных и хронических инфекциях.



Недостатки метода ПЦР

1. Амплифицируется ДНК как живого, так и погибшего микроорганизма.

А) Это налагает определенные требования при использовании ПЦР для контроля эффективности лечения. В общем случае подобный контроль должен проводиться спустя промежуток времени, в течение которого происходит полная элиминация (отсутствие возбудителя в организме)возбудителя.

Б) Для правильной интерпретации результатов необходимо также знать, что выявление ДНК возбудителя не всегда говорит о состоянии его жизнеспособности ( возможно организм контактировал с возбудителем, но иммунная система справилась без лечения), а также о непосредственной связи выявленного инфекционного агента с конкретным патологическим процессом.

2. Высокая чувствительность. Ряд микроорганизмов (условно - патогенная флора, УПФ) в норме может существовать у человека в малом количестве. При помощи метода ПЦР определяются даже самые малые количества УПФ, даже при отсутствии патологии.
Чрезвычайная чувствительность метода требует строго соблюдения специального технологического режима, тщательного выполнения всех этапов анализа в отдельных изолированных зонах лаборатории. Недостаточная внимательность к процедурным тонкостям влечет неизбежную контаминацию( заражение ) проб и появление ложно- положительных результатов.

3. Различия при использовании разных тест систем. Как говорилось выше, для амплификации можно использовать различные участки генома возбудителя. Однако в случае различных мутации микроорганизмов возможно изменение или утрата генов. Это приводит к разным результатам при использовании тест систем разных производителей.
Широкое использование недостаточно отработанных тестов при диагностики урогенитальных заболеваний, к сожалению, часто приводит к неверному результату и необоснованному назначению дорогостоящей терапии, иногда оставляющей массу побочных эффектов. Таким образом, недобросовестное проведение анализа ведет к незаслуженной дискредитации метода.

Результат ПЦР значительно увеличивает свою информативность при комплексном обследовании пациентов с дополнительным использованием других лабораторных (иммуноферментных, биохимических и др.) и клинических исследований.